wb实验全称叫什么?
wb实验全称叫免疫印迹实验。免疫印迹试验(westernblot,WB)是普遍用以很多传染性疾病确诊的实验方法,就HIV的病原学确诊来讲,它是优选的用于确定HIV抗原的确定实验方法,WB的检验结果经常被做为辨别别的检测方式好坏的金标准。
wb的实验步骤
制样:裂解缓冲液或者超声处理。(使用RIPA裂解液是需按照100:1加入蛋白酶抑制剂)。电泳:根据蛋白大小确定合适的PAGE胶浓度,推荐上样量为20-30ug总蛋白。转膜:湿转和半干转都可。但在待检测蛋白分子量较大或低内源水平湿转移方法更佳。洗膜:10min/次*3次。
封闭:含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1h。洗膜:TBST中洗涤10min。孵育-抗:-抗应在含5%BSA或5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中稀释,参考产品说明书选择合适的一-抗稀释比例。5%推荐使用脱脂奶粉的TBST缓冲液,背景相对较低。-抗4°C孵过夜更好。
洗膜:10min/次*3次。孵育二抗:建议在含5%脱脂牛奶TBST中稀释-抗参考生产商建议选择合适的二抗稀释比例。洗膜:10min/次*3次。检测:化学发光检测。
ELISA,WB,三者之间有什么区别
WB
只能定性,半定量。
ELISA 可用定量方法检测蛋白,也就是说你可以观察不同浓度***物对目的蛋白的影响。
WB所检测的一般是抗原,而Elisa抗原抗体都可以检测。
WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小,或是否是多聚体、降解产物等。
一般Elisa的灵敏度要远高于WB,这从一般酶标记物的使用浓度或待检样品的稀释度上就可以看出。
WB一次样本量就是一块胶,10-20个样品最多了。Elisa一块96孔板一次可以处理96个样本,可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。
WB实验时间时间更长,操作更繁琐。Elisa
有很多现成的试剂盒,按照说明书操作即可。
蛋白丰度值对wb检测有什么影响
蛋白丰度值对wb检测的影响主要体现在上样量上
上样量一般根据目的蛋白的丰度会有一个大致的范围,如果上样量太少,wb可能检测不出目的蛋白。上样量也不能太大,会造成样品的浪费,影响效果甚至会超过泳道的负荷。
所以蛋白丰度值对wb检测的影响主要体现在上样量的区别上
wb实验步骤
wb实验步骤如下:
WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将混合蛋白质样品分离后,利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质(例如PVDF膜)上,再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原。
与相对应的***抗体特异性结合,之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合,最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
wb实验原理及流程图如下所示:
蛋白质样品制备:
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白,以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献。
注意事项:
1、将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;1min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入X-光片夹中。
2、在暗室中,将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中;在红灯下取出X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)。
打开X-光片夹,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min或5min,也可选择不同时间多次压片,以达***效果;曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。
显影时间一般为1~2min(20~25℃),温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间;显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中,定影时间一般为5~10min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。
wb实验的原理和步骤
WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将混合蛋白质样品分离后,利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质(例如PVDF膜)上。
再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与相对应的***抗体特异性结合,之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合,最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
扩展资料:
WB,蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting),是采用印迹技术将蛋白质转移到膜上,再根据抗原-抗体的特异性结合,检测复杂样品中的某种蛋白的方法,该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
一、蛋白样本提取制备
1 细胞或组织裂解
2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂
3 蛋白定量
4 电泳上样样品的准备
二、 电泳
1 PAGE 胶的制备
2 蛋白分子量 Marker
3 阳性对照
4 内参对照
5 上样与电泳
三、 转膜与显色( Western Blot)
1 胶中蛋白的检测
2 蛋白转膜
3 膜上蛋白的检测:丽春红
4 膜的封闭
5 一抗的孵育
6 二抗的孵育
7 显色
四、常见问题分析与解决方案
五、试剂及缓冲液配方
一、蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是 Western Blotting 的***步,是决定 WB 成败的关键步骤之一。
蛋白提取总体原则与注意事项包括:
1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白(通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品)。
2) 保证蛋白处于可以溶解状态(通过裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等的选择实现)。
3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等(全程保证在冰盒中低温操作,加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂)。
4) 尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略)。
5) 样品分装,长期于-80℃中保存,避免反复冻融。
wb磷酸化和非磷酸化怎么定量
1、样本是否表达:
查阅资料或通过预实验确定。
2、对照设置:
阳性和阴性对照。
总蛋白抗体对照,对于特定时间的特定样品,磷酸化和非磷酸化蛋白质的总和代表该特定蛋白质的总量。在相同的 WB 检测中, 磷酸化蛋白质的量增加通常伴随着非磷酸化蛋白质的降低。
3、内参设置:
根据实验选择合适的内参,如Actin、GAPDH 等
4、适当的提取方法:
蛋白质提取的方法不仅影响提取效率,还会影响蛋白的质量。建议采用裂解液裂解和超声破碎组合的方式,可确保整个样本充分裂解。
5、低温操作:
室温条件下,磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。请勿反复冻融,操作时一定置于冰上。
6、加入抑制剂:
组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶,它会导致磷酸化蛋白的去磷酸化,因此,必须在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂。
7、最重要的一点:
检测时选择近红外荧光标记抗体,一次可检测多个蛋白,无需多次曝片,方便检测。一般磷酸化和总蛋白的条带位置十分接近,传统方式不易区分。
不同于其他产品,Azure C系列产品检测近红外时,采用的是激光光源。由于近红外荧光染料激发波长和发射波长非常靠近20nm,只有激光才能取得***的检测效果。
这样大家在用WB检测磷酸化水平时,是不是就方便多了,不用像传统方法那样,在压完磷酸化抗体后,将膜 strip 后再压总蛋白抗体;也不需要同时跑两块胶分别检测。
使用近红外荧光标记抗体(二抗),孵育后直接放入仪器,一键成像,简单快速,是您的不二之选!
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